PEG的修飾作用和PEG修飾方法
摘要：聚乙二醇修飾即PEG化，是將活化的PEG通過化學方法以共價鍵偶聯到蛋白質或多肽分子上。自Davis1977年首次用PEG 修飾牛血清白蛋白以來，PEG修飾技術廣泛應用于多種蛋白質和多肽的化學修飾，多個PEG修飾藥物上市或在臨床研究中。 PEG修飾具有半衰期延長、免疫原性降低或消失、毒副作用減少以及物理、化學和生物穩定性增強等。
關鍵詞:PEG(聚乙二醇)；修飾
高分子聚乙二醇（PEG）由于其毒性小、無抗原性、具有良好的兩親性，且生物相容性已獲FDA認可，對蛋白質的改造具有無可取代的優勢。聚乙二醇化修飾技術通過共價鍵，將聚乙二醇與被修飾藥物耦聯，改善藥物的理化性質和生物學活性，這種技術現已廣泛應用于蛋白質(肽類)、酶、抗體及小分子藥物。
聚乙二醇具有較廣的分子量分布，隨著平均分子量的不同，性質也產生差異，當分子量小于1000Da時，聚乙二醇是無色無臭粘稠的液體，高分子量的聚乙二醇則是蠟狀白色固體，固體聚乙二醇的熔點正比于分子量，逐漸接近67℃的極限。毒性隨分子量的增加而減少，小于400Da的 PEG在體內會經乙醇脫氫酶降解成有毒的代謝物，而分子量大于1000 Da的PEG經過多年應用于食品業、化妝品業和制藥業證明沒有毒性。
聚乙二醇分子中含有大量乙氧基，能夠與水形成氫鍵，因而具有良好的水溶性，同時又可溶于除乙醚、己烷、乙二醇以外的大部分有機溶劑。大多數蛋白質經聚乙二醇修飾后，除保留或增加其水溶性外，還可以獲得在一些有機溶劑中的溶解性。在蛋白質溶液中，聚乙二醇無論是處于游離還是結合形式，即使濃度很高，對蛋白質分子都沒有副作用。聚乙二醇修飾的蛋白質一般構象不會改變，其結合物的生物學活性主要由結合物的蛋白質部分產生。
聚乙二醇具有免疫學惰性，即使分子量高達5.9×106Da，本身的免疫原性也很低。臨床上使用聚乙二醇修飾蛋白治療未發現抗聚乙二醇抗體產生。
在20種構成蛋白質的常見氨基酸中，只有具有極性的氨基酸殘基的側鏈基團才能夠進行化學修飾。常用的反應氨基酸包括賴氨酸、半胱氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸，N-端氨基和C-端羧基。這些氨基酸殘基上的反應性基團多呈親核性，其親核活性通常按下列順序依次遞減：巰基>?氨基>?氨基>羧基(羧酸鹽)>羥基。根據化學修飾劑與蛋白質之間反應性質的不同，修飾反應主要分為?；磻?、烷基化反應、氧化還原反應、芳香環取代反應等類型，對蛋白質進行氨基、巰基和羧基等側鏈基團進行化學修飾。巰基通常存在于蛋白質的二硫鍵和活性位點上，而羧基如果不與蛋白質上的氨基發生分子間或分子內中和反應，也很難活化。因此，蛋白質或多肽分子最容易與修飾劑發生作用的位點是分子表面賴氨酸殘基上的氨基，包括?氨基或?氨基。
聚乙二醇修飾又稱分子的PEG化（PEGylation），是20世紀70年代后期發展起來的修飾方法。將活化的聚乙二醇與蛋白質分子相偶聯，影響蛋白質的空間結構，最終導致蛋白質各種生物化學性質的改變：化學穩定性增加，抵抗蛋白酶水解的能力提高，免疫原性和毒性降低或消失，體內半衰期延長，血漿清除率降低等。
1 PEG化學結構及性質
1.1 PEG化學結構
結構式CH2（OH）-（CH2CH2O）n -CH2OH
1.2 PEG性質【1】
聚乙二醇系列產品通常情況下溶于水和多種有機溶劑，不溶于脂肪烴、苯、乙二醇等，不會水解變質，有廣泛的溶解范圍和優良的相容性、很好的穩定性、潤滑性、成膜性、增塑性、分散性等。系低毒物質，且無刺激性，屬非離子型聚合物。
2 聚乙二醇修飾劑
根據化學修飾劑與蛋白質之間反應性質的不同，修飾反應主要分為?；磻?、烷基化反應、氧化還原反應、芳香環取代反應等類型，對蛋白質進行氨基、巰基和羧基等側鏈基團進行化學修飾。根據被修飾化合物包括蛋白質、多肽、單克隆抗體分子片段、以及小分子化合物等的不同分子量大小、分子結構以及其理化特性，公司采取不同的聚乙二醇化技術方法對這些化合物進行修飾【2,3】。
2.1隨機修飾
隨機修飾蛋白質多以賴氨酸的ε-NH2或α-NH2為修飾目標，由于賴氨酸在蛋白質內通常數量較多，這種修飾引起蛋白質中多個賴氨酸被修飾，得到的產物是聚乙二醇化修飾異構體的混合物，目前FDA批準的已經上市的聚乙二醇化新藥多數為隨機修飾的產物。
2.2定點修飾
聚乙二醇化定點修飾，是在隨機修飾的基礎上發展起來的第二代聚乙二醇修飾技術，通過對修飾方式、PEG修飾劑和反應pH等的優化選擇，實現定點修飾，這種修飾所得的產物為均一產物，異構體少，活性保留較好，免疫原性大大降低。
2.2．1?N端氨基定點修飾
由于蛋白質、多肽中存在多個α-NH2 和ε-NH2基團，氨基的隨機修飾可能導致藥物活性的明顯下降，這給蛋白質、多肽的修飾帶來了障礙。目前我們采取對N端氨基定點修飾，特別是對于遠離活性中心的 N端定點修飾可以有效地保持藥物的原有生物活性。
2.2.2巰基定點修飾
結合基因工程技術或Mutagenesis等方法，將巰基或一些特異性基團引入到蛋白、多肽預設位點（如不影響活性的糖基化位點、抗原決定簇等）后，再進行對該基團的修飾，這樣就可得到活性保留較高和免疫原性降低的定點修飾產物。
2.2.3羧基定點修飾
采用帶酰肼活化基團的聚乙二醇衍生物對蛋白質、多肽進行羧基基團進行修飾， 同樣可以獲得定點的修飾產物。
2.2.4酶催化修飾
采用酶催化手段誘導聚乙二醇分子與蛋白質、多肽等分子上特定的位點進行定向修飾。此方法具有一下特點：1）不需要對原蛋白質、多肽進行結構改造，保持原化合物的理化特性不受改變；2）定點修飾；3）工藝簡單，容易大規?；a和質量控制。
3 PEG修飾對蛋白質的影響
3.1 增加溶解度和穩定性
藥用PEG易溶于水和大多數極性溶劑，不溶于脂肪烴類、苯和礦物油等非極性溶劑【4】。隨相對分子質量升高，起在急性溶劑中的溶解度逐漸下降。由于PEG共價連接蛋白質等高分子后，其天然構象產生一定的剛性，不易伸展失活，減少了分子內部基團的熱震動，從而增加了熱穩定性。
3.2 減少免疫原性和抗原性，降低毒副作用
消除或降低蛋白質等高分子的抗原性效果明顯【5】。L-天門冬酰胺酶用PEG修飾后可消除抗原性。
3.3 延長血漿半衰期和增加體內系統暴露
許多蛋白質等高分子經PEG 修飾后，抗蛋白水解酶、抗抑制劑等失活因子的能力和熱穩定性提高，其體內半衰期比天然蛋白質等高分子長，對提高蛋白質等高分子的藥用療效極具意義【6】。L- 天門冬酰胺酶經PEG 修飾后，體內半衰期可延長13 倍。
一些蛋白質等高分子經PEG 修飾后可改變組織的分布能力，能在血液中被靶器官選擇性吸收【7】。
3.4 增加體內生物活性和療效
一些PEG 修飾后的蛋白質等高分子抗蛋白水解酶水解、抗抑制劑、抗酸堿和有機溶劑等變性失活能力提高【8】。原因是PEG 所產生的空間屏蔽阻擋了失活因子的進攻。此外，蛋白質等高分子中對蛋白水解酶等失活因子敏感基團被修飾，使其能力提高。過氧化氫酶經PEG 修飾后，抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解能力明顯提高。
3.5 減少給藥次數，降低病人痛苦
PEG 可使大多數蛋白質等高分子毒性減少，且本身無毒性(相對分子質量>1 000)，相對分子質量為4000 的PEG 可按每千克體重16g 的劑量，以10%的溶液安全地注射入鼠、兔、猴等動物體內【9,10】，不傷害蛋白質和細胞【11】。
4 PEG 修飾的應用
化學藥物或蛋白質藥物等在產生作用的同時，一般都存在自身無法克服的問題； 如較短的作用周期，較大的抗免疫原性及毒副作用。聚乙二醇化技術是一種將聚乙二醇活化后鏈接到藥物分子或藥物表面的技術。聚乙二醇可以增加藥物的水溶性，降低毒副作用，減少免疫原性，提高藥物在體內的穩定性，同時延長藥物循環半衰期。
4.1尿激酶(UK)
尿激酶主要是相對分子質量為31 300 和54 700的高分子物質。尿激酶是一種堿性蛋白酶，由腎臟產生，主要存在于人及哺乳動物的尿中，人尿平均含量5~6 U/ml。尿激酶也具有酯酶活力，目前已廣泛應用于治療各種心血栓和血栓梗塞疾病【12】。
4.2 PEG的活化及對殼聚糖的修飾作用
用聚乙二醇 (ＰＥＧ)修飾殼聚糖可望使二者的優良性質得到有利結合。提高殼聚糖作為生物醫學工程材料的生物相容性 ,改進吸附性能等重要作用。ＰＥＧ末端羥基可以進行多種活化【13】。
4.3人紅細胞生成素(EPO)
沈富兵等【14】研究了PEG化重組人紅細胞生成素(在動物體內的作用。經動物皮下注射后比較PEG化重組人紅細胞生成素與普通人紅細胞生成素在網織紅細胞百分數、用藥頻度、腎性貧血糾正及對病模動物的保護作用。表明PEG化重組人紅細胞生成素網織紅細胞百分數升高持續時間可達7 d 以上，而普通人紅細胞生成素組只能達到4 d ；在周劑量(0.08 μg/ 只)相同的條件下，PEG化重組人紅細胞生成素 每周給藥1 次，小鼠紅細胞比容(HCT)增高15.3%，與普通人紅細胞生成素每周給藥3 次的HCT 增高13.4% 的效果相當，而與普通人紅細胞生成素每周用藥1 次的HCT 增高6.0% 有明顯差異。在病模大鼠的貧血治療實驗中，PEGEPO不僅每周1 次給藥能達到普通人紅細胞生成素每周3 次給藥的效果，而且對患病大鼠的死亡保護作用也遠優于普通人紅細胞生成素。說明PEG化重組人紅細胞生成素作用時間持久，用藥次數少，糾正貧血效果明顯，保護效果良好。
5結語
以上所述的以PEG 修飾的蛋白質等高分子雖然具有一定的代表性，但僅僅是此方面的部分實例。相信隨著生物經濟時代的來臨，以PEG 修飾蛋白質等高分子將會得到更多的應用，會為人類的健康和社會的進步作出更大的貢獻。
PEG修飾方法—聚乙二醇修飾蛋白質的活化與檢測方法
摘要 聚乙二醇共價修飾蛋白質藥物可以消除蛋白質藥物的抗原性及免疫原性 延長小分子
多肽在體內的半衰期本文對該項技術最近的制備分離分析方法及各種方法的優缺點作一介紹并對不同蛋白質需采用的分析方法提出了一點建議。
關鍵詞聚乙二醇 修飾 活化 分離 分析
近年來隨著基因工程技術的發展用于疾病治療的多肽酶細胞因子等蛋白類藥物越來越多地被研究開發這類藥物具有專一性強時效高等優點但也有許多不盡人意的地方如(1)大多數藥物具有抗原性及免疫原性(2)容易從循環系統中被快速清除(3)定位給藥困難(4)不穩定容易被酶類降解且來源稀少等[1] 為了克服基因工程蛋白類藥物的上述缺陷許多研究人員正設法對蛋白質進行結構改造或化學修飾[2~4]
化學修飾法是指在分子水平上對蛋白質進行改造，即在體外將蛋白質的側鏈基團通過人工方法與一些化學基團，特別是具有生物相容性的大分子進行共價連接，從而改變蛋白質的性質。
? ? ? ? 其主要優點是可以延長蛋白質在體內的半衰期、降低免疫原性和抗原性；另外還可以減弱蛋白酶的水解作用，增加蛋白分子的可溶性等。蛋白質的免疫原性是由于其分子表面的抗原簇所決定的，應用線性、親水、惰性的高分子與蛋白質的非活性必需基團結合，在其表面形成屏蔽，使其不被識別不產生相應抗體，從而抑制相應的免疫反應；而連接大分子聚合物后，藥物的分子量顯著增大，不易被腎小球所過濾，從而延長在體內的半衰期。另外，由于大分子親水性、聚合物的表面遮蔽作用在一定程度上減少了蛋白藥物與蛋白酶的相互作用，使藥物的穩定性進一步提高用于蛋白質修飾的大分子，很多常見的有如下類型聚乙二醇(包括聚乙二醇PEG和單甲基聚乙二醇mPEG) 多糖類如葡聚糖、右旋糖酐、淀粉等同源蛋白質及人工合成的多肽，如聚丙氨酸等，其中聚乙二醇由于其良好的生物相容性、反應簡單、價格低廉等優點，受到較多的重視[1] 本文著重介紹聚乙二醇修飾蛋白質的活化方法分離純化及其分析方法等。
1 聚乙二醇的活化
聚乙二醇修飾蛋白質主要通過聚乙二醇的末端羥基與蛋白質的氨基酸殘基反應而實現，但聚乙二醇的末端羥基活性很差，很難在溫和的環境中與蛋白質進行偶聯反應，所以必須使用活化劑活化該羥基，使活化的聚乙二醇能在溫和的環境中對蛋白質進行共價修飾。近年來聚乙二醇的活化方法已成為該領域的研究熱點之一。
1.1 非特異性活化方法
1.1.1 溴化氰法?色譜或層析的固相載體最早的活化方法之一即溴化氰活化法 高pH 時溴化氰與載體內部的羥基反應轉化成氰酸酯和亞氨基碳酸酯后來該方法也應用于帶羥基的高分子聚合物的活化其方法操作簡單容易重復而且反應環境溫和但其偶聯后的配基(包括蛋白質R-NH2)很容易脫落這種脫落主要是由于活化載體和含氨基配基之間形成不穩定的異脲鍵所引起的[5] 加之溴化氰有毒操作須在通風櫥中進行該方法逐漸被其它方法所取代。
1.1.2 羰基二咪唑法??該方法最早用于多肽的合成 被證明是形成酰胺鍵的良好試劑含羥基的載體可與羰基二咪唑(CDI)反應得到活潑的?；溥虻鞍字匈嚢彼釟埢牟被膳c其迅速反應形成穩定的酰胺鍵這種化學鍵比較穩定偶聯上的蛋白不易脫落[5]。
CDI 活化PEG 需注意(1)CDI 遇水生成CO2 和咪唑所以活化反應宜在有機溶劑中進行且溶劑不能含水(2)活化后的聚乙二醇最好在低溫下洗滌以保持高反應活性(3)活化后的聚乙二醇應用冷凍干燥法除去殘留的有機溶劑以免使偶聯的蛋白失效(4)偶聯蛋白質的緩沖液中勿含有胺類(如Tris 或甘氨酸) 否則它將與待連接的蛋白分子競爭偶聯。
1.1.3 N-羥基琥珀酰亞胺法 (a)N,N-琥珀酰亞胺碳酸酯活化此反應也需要在無水條件下進行。
(b)琥珀酸酐及N–羥基琥珀酰亞胺活化?該方法活化得到的聚乙二醇活性較高最好是在非水環境中進行蛋白的偶聯但對于多數生物大分子來說都是優先考慮水溶液系統而且在4°CpH=8 時活化聚乙二醇在水中的半衰期為20min 左右所以偶聯反應最好在低溫下20min 內完成，周笑艷等用該方法對天冬酰胺酶進行修飾取得了較好的效果[4]
1.1.4 氰脲酰氯法??氰脲酰氯又名三氯化嗪(TST) 是對稱雜環化合物含有三個活性酰氯鍵廣泛應用于染料行業TST 上的三個氯原子很容易發生親核取代反應而且一個氯原子的取代可以穩定其它酰氯鍵所以第一個氯原子在4°C 就可以反應第二個在25°C 反應第三個在80°C 才反應David 等利用TST 與聚乙二醇上的羥基反應只有一個氯原子被取代其它的氯原子與蛋白質的氨基反應為抑制氯原子的親核活性以控制反應的速度及修飾度可先加入苯胺取代其中一個氯原子剩下的氯原子用于蛋白質的偶聯該反應雖說簡單易行但由于TST的毒性以及鹵原子過強的親核活性使其應用受到限制
1.1.5 光氣參與的活化方法??Kurfuerst 等在其專利中提到一些方法[6] 分別用N-羥基琥珀酰亞胺鉀鹽硝基苯酚及三氯苯酚與光氣反應制備活化聚乙二醇活化主要分兩步如圖6 所示。
這些活化劑都應與聚乙二醇在有機相反應操作方法類似活化效果和配基偶聯效果還沒有具體評價但該反應由于有光氣參與毒性極強增加了操作的復雜性。
1.1.6 改變聚乙二醇結構以提高修飾效果改變聚乙二醇的結構 將聚乙二醇的結構由線狀改為叉狀或梳狀也可以起得到更好的修飾效果。
其優點主要體現在
(1)叉狀聚乙二醇可以減少蛋白酶與蛋白質的接觸以減弱其水解作用
(2)聚乙二醇結構變化造成的空間位阻效應減少了聚乙二醇與蛋白質的結合位點減少蛋白質失活
(3)聚乙二醇對蛋白質的屏蔽效應更為顯著更好地降低蛋白藥物的抗原性和免疫原性
Schiavon 等用線狀和叉狀聚乙二醇分別修飾尿酸酶[8] 結果如表1
由表1 可以看出叉狀聚乙二醇修飾蛋白質可以很好地保留蛋白的生物活性，另外通過增長活化端與聚乙二醇鏈之間的距離或在a-C 上增加支鏈可以延長活化的聚乙二醇在水中的水解半衰期從而有望提高修飾效果如表2
經PEG 修飾后的蛋白質是十分復雜的混合物這是由于
(1)PEG 聚合物分子量分布較寬，如PEG5000 的分子量分布在5000 500 道爾頓范圍內
(2)由于被修飾蛋白質上待連接的活性位點的活性不同空間位阻不同導致每個蛋白分子上連接的PEG 數和PEG 連接的位置不同如超氧化物歧化酶(SOD)有20 個可能的PEG 連接位點理論上大約有2020 種不同的反應產物
(3)活化的聚乙二醇中還殘留未反應的活化劑未活化的mPEG 等因此經PEG 修飾后的蛋白質必須進行分離純化一般用色譜方法純化PEG 化蛋白質連接PEG 后蛋白質的分子量有了不同程度的提高要想將其逐一分開體積排阻色譜(SEC)就成了首選的方法但SEC 分離同一數量級的物質效果不好所以對于分子量小且修飾位點少的多肽和小分子蛋白質該方法也不是很理想由于PEG為弱疏水性長鏈連接PEG 后蛋白質分子的疏水性有所增強所以也可以用反相高效液相色
譜(RP-HPLC)分離但其分離條件的摸索較為煩瑣再者由于連接了PEG 蛋白質分子上的氨基等活性位點減少其等電點pH 都發生了變化所以用離子交換色譜(IEC)理論上也可以將其分離Malik 等的研究表明PEG 化蛋白質的純化難度很大且純化產量很低[10] Busby 和Ingham認為分離難度大的原因在于PEG 在水溶液中具有伸展構象其流體動力學體積遠遠大于同樣分子量的蛋白質例如mPEG6000 不能通過截留分子量為12KD 的半透膜在體積排阻色譜中PEG6000 的行為類似于分子量25 35KD 的球狀蛋白質[11] 采用切割分子量為30000Da 或50000Da 的超濾膜過濾可有效去除mPEG 但該方法不適用于小分子多肽迄今為止常用的分離方法是先用超濾或透析去除咪唑等小分子活化劑殘余物然后再用
各種色譜法分離如 Snider 等用各種色譜法考察PEG-SOD 的多態性[12] Mcgoff 等用體積排阻色譜和離子交換色譜對PEG-SOD 進行分離及分析[13] 唐微等先利用硫酸銨對反應后的混合物進行蛋白質沉淀有效地去除了溶液中的PEG 然后再對離心出的蛋白質進行體積排阻色譜分離分離效果較以前好[11] 但該方法同樣也不適于小分子多肽因為小分子多肽不容易被鹽析沉淀另外Zhao 等用異丙醇沉淀活化后的聚乙二醇分子可有效去除反應時的極性溶劑和副產物活化聚乙二醇的收率達90%以上[23]
PEG 化蛋白質的檢測與分析至少應該有三個方面(1)蛋白的平均修飾度(2)PEG 修飾的位點及特定位點被修飾程度(3)不同修飾度的蛋白質的相對含量[14] 其中PEG 修飾的特定位點及特定位點被修飾程度的檢測目前尚未見報道現將幾種常用的檢測分析方法介紹如下。
3.1 色譜法
如果用色譜法可以將聚乙二醇反應后的混合物逐一分離則可以繪制隨濃度變化的工作曲線根據工作曲線來為各個組分定性及定量從而確定混合物的平均分子量和平均修飾度但由于PEG 化蛋白質的多樣性以及PEG 在溶液中影響蛋白質的色譜行為色譜法分析并不是最好的分析方法其分辨率很低譜帶寬且包含多種混合成分另外由于蛋白質的多樣性定性
及定量也會有困難Snider 等分別利用高效離子交換色譜高效體積排阻色譜高效反相液相色譜等對PEG-SOD
作分析結果顯示其分辨率很低不能將各種分子逐一分析譜帶寬且雜亂[12] Mcgoff 用體積排阻色譜對PEG 化的SOD 進行分析SOD 為一尖銳的峰而PEG 化的SOD 則為一寬峰而且不能分離完全[13] 但對于修飾位點少的蛋白質或多肽而言色譜法效果較好如Brian Fenton等用RP-HPLC 對PEG-Hirudin(水蛭素)分析由于水蛭素只有三個修飾位點其產物較少可以很清楚的看出有三個峰分別為PEG-Hirudin (PEG)2-Hirudin (PEG)3-Hirudin[15]凝膠滲透色譜(GPC)屬于凝膠色譜的一種凝膠色譜以多孔性填料為固相填料上有許多大小不一的孔徑據樣品的尺寸大小實現分離以有機溶劑(如甲苯四氫呋喃等)為流動相的稱為凝膠滲透色譜以水溶液為流動相的稱為凝膠過濾色譜有機相能很好的溶解大分子PEG Bullok 等用堿水解使蛋白質與PEG 分離再對水解下來的PEG 進行凝膠滲透層析通過測定PEG 的量以測修飾度[16] 但該方法可能因為水解不徹底和樣品中含有游離的PEG 而受干擾。
3.2 SDS-PAGE 凝膠電泳法
凝膠電泳是蛋白質分析中十分常用的方法其分辨率高且可以測定分子量但該法在測定PEG 化蛋白質的分子量方面卻存在很多缺陷由于PEG 在蛋白質表面的屏蔽作用和PEG 分子與凝膠分子的纏繞作用使PEG化的蛋白質在凝膠中的遷移速度減慢測出的分子量偏大Kurfurst用常規的電泳法測定PEG 修飾后的水蛭素分子量結果比理論值大一倍以上用碘化鋇將PEG染色根據PEG 標準曲線測定分子量其值要準確的多Kurfurst 還用等電聚焦法分析PEG 修飾后的水蛭素證明有三種物質Hirudin PEG-Hirudin (PEG)2-Hirudin[17]另外用毛細管區帶電泳對PEG 化蛋白質的分析也屢見報道由于蛋白質的疏水作用靜電作用和其它多種兩相分配機制毛細管中的蛋白質容易吸附在管壁上尤其是堿性蛋白質的
靜電吸附最為突出這樣使毛細管電泳的分離效率下降峰高降低甚至不出峰為克服蛋白吸附常采用化學方法來消除或覆蓋管壁上的硅羥基使石英表面轉化成高分子涂層[18] Cunico等通過改性劑使毛細管柱內壁帶正電荷電滲流從通常的正極到負極方向變為負極到正極方向減少了蛋白在毛細管內壁的吸附同時也提高了分離度[19]
3.3 分光光度法
自從1960 年Satake 等介紹用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)法測定蛋蛋白質氨基濃度以來該方法已成為測蛋白質修飾度最常用的方法TNBS 與蛋白質反應蛋白質的賴氨酸殘基的氨基末端進攻TNBS 的磺酸基并將其取代形成的復合物有特定的光吸收以此測定其含量。
該方法簡單易行因此得到廣泛應用但該方法存在如下缺陷(1)TNBS 與蛋白質反應受pH 影響較大所以實驗前應先測定佳pH (2)對于較小的蛋白質該方法精確度不高但Snyder 等在此基礎上對TNBS 法進行改造使該法精確性又有所提高[20]Stock 等采用熒光胺法測定修飾度熒光胺與蛋白質賴氨酸殘基的氨基末端發生反應生成的產物有特定的光吸收通過測定蛋白質混合物所激發的熒光值來測定其平均修飾度該方法靈敏性很高僅需納克級的蛋白質就能完成但這類方法所用的PEG 衍生物較昂貴不適于常規分析[21]
3.4 其它方法
質譜法是測定物質結構的重要手段近年來一種新型的質譜方法-基體輔助激光解析電離質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization MS, MALDI-MS)被成功地用于PEG 修飾蛋白組分的定性與定量分析該質譜最大特點是可以分析高分子量的生物大分子被測分子量可達50 萬道爾頓紅外光譜也是鑒別化合物確定分子結構常用的手段之一對單一組分或混合物中各組分也可以進行定量分析由于拉曼散射光的頻率位移對應于分子的能級躍遷因此拉曼光譜也成為人們研究分子結構新的手段之一Bullock 等報道紅外光譜測定相對而言較為快速直接不需要對樣品進行預處理可以根據C O C 鍵的吸收強度給聚乙二醇定量但必須假設連接了SOD 和沒有連接SOD 的聚乙二醇的C O C 鍵的吸收強度相同另外由于紅外光譜對PEG-SOD 中的PEG 沒有特征吸收所以游離PEG 的量需要用GPC 法檢測并扣除而且該方法確定修飾度還需要知道精確的蛋白質含量這也可能成為誤差來源拉曼光譜樣品制作簡單檢驗靈敏但同紅外光譜有相同的缺點MALDI-MS 光譜與毛細管電泳譜十分相似但精確性比毛細管電泳差而且與紅外光譜和拉曼光譜有同樣的缺點[16]
PEG 修飾技術在蛋白質藥物的應用上起著越來越重要的作用目前已上市的藥物有Enzon和Rhone-Poulenc Rorer 公司的抗癌藥Oncaspar(PEG-L-ASP 天冬酰胺酶) 羅氏公司治療丙肝病毒的PEG-Intron(PEG-IFN-a-2a) 已獲FDA 批準用于多種嚴重免疫缺陷治療的PEG-ADA(腺苷脫氨酶) 還有PEG-水蛭素等多種藥物正處于臨床實驗階段針對不同的酶多肽或蛋白選擇適宜的PEG 活化和偶聯方式以及相應的產物分離與檢測方法各種方法都有其適用范圍和局限性至今還沒有通用的方法可供選擇隨著PEG 修飾技術研究的不斷深入各種修飾特異性好修飾率高操作簡便偶聯產物穩定的活化劑不斷涌現必將進一步提高聚乙二醇修飾蛋白質的特異性從而使產物的分離純化和分析檢測更加簡單易行這是PEG 修飾技術發展的必然要求。