【摘要】糖化酶有催化淀粉水解的作用，能從淀粉分子非還原性末端開始，分解α-1,4-葡萄糖苷鍵生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸鈉氧化，過量的次碘酸鈉酸化后析出碘，再用硫代硫酸鈉標準溶液滴定，計算酶活力。1g固體酶粉（或1ml液體酶），于40℃、pH值為4.6的條件下，1h分解可溶性淀粉產生1mg葡萄糖，即為1個酶活力單位，以u/g（u/ml）表示。

【關鍵詞】 ????葡萄糖 ????淀粉酶 ???活力測定 ????酶活力

【引言】酶作為生物體內催化劑，測定其活力是非常有必要的。不同種類的酶的活力測定方法不同。按照淀粉酶水解淀粉的作用方式，可以分為α-淀粉酶和β-淀粉酶等。根據其催化產物的特點和現有測定方法規定酶活力單位為：每分鐘每克鮮重麥種所催化生成的麥芽糖毫克數，來對這兩種酶進行有效的測定。兩種酶作用淀粉的方式不同。α-淀粉酶可隨機地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時使淀粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。β-淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進行水解，每次水解下一分子麥芽糖，又被稱為糖化酶。淀粉酶催化產生的這些還原糖能使3,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。淀粉酶活力的大小與產生的還原糖的量成正比。用標準濃度的麥芽糖溶液制作標準曲線，用比色法測定淀粉酶作用于淀粉后生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時間內生成的麥芽糖的量表示酶活力。

一．實驗原理：葡萄糖淀粉酶（糖化酶）在一定的條件下能水解生成葡萄糖，葡萄糖的醛基被弱氧化劑次碘酸鈉氧化。過量的碘用硫代硫酸鈉滴定。從碘的減少量計算葡萄糖的量，從而計算酶活力。

二．試劑與材料：

1.2%可溶性淀粉液：稱取可溶性淀粉2g，以少許蒸餾水調勻，侵入80ml的沸水中，繼續煮至透明狀，冷卻后，加水定容至100ml

2.PH4.6，0.1mol/L醋酸緩沖液：0.1mol/L蘇酸溶液與0.1mol/L醋酸鈉溶液等體積混合。

3.0.1mol/L碘液：稱取36g碘化鉀，溶于100ml蒸餾水中，加入14g碘，逐漸溶解，加3滴鹽酸，定容至1000ml

4.0.1mol/L氫氧化鈉溶液：稱取4g NAOH，用水溶解，定容至1000ml

5.1mol/L硫酸溶液。量取56ml濃硫酸，倒入適量水中，用水稀釋至1000ml

6.0.05mol/L硫代硫酸鈉溶液：稱取25g硫代硫酸鈉，0.2g碳酸鈉，溶于1000ml煮沸冷卻后的水中，存于棕色瓶。放置一周后，用0.1mol/L重絡酸鉀滴定。

7.0.5%淀粉指示劑：稱取0.5g可溶性淀粉用少量水調勻。倒入80ml沸水中，繼續煮至透明，冷卻后，定溶100ml

三．實驗步驟：

????1.吸取2%可溶性淀粉液10ml，加入PH4.6醋酸緩沖液5ml，混勻后于40℃水浴中預熱10min

2.加入酶液1ml，于40℃，反應10min。反應結束時，沸水中煮10min，以終止酶反應。

3.吸取上述反應液5ml于碘量瓶中，加入0.1mol/L碘液5ml及0.1mol/L NAOH溶液5ml，混勻，于室溫下暗處放置15min，加入2mol/L硫酸酸化。

4.以0.5%可溶性淀粉液作為指示劑，用0.05mol/L硫代硫酸鈉滴定至藍色消失為終點。記錄0.05mol/L硫代硫酸鈉消耗的毫升數（A），以及空白試驗消耗的硫代硫酸鈉毫升數（B）。

四．結果計算：

在上述條件下，每小時催化淀粉水解生成1mg葡萄糖的酶量定義為一個酶力單位。

???????????????酶活力=（B-A）×c×90.05×16/5×60/10

式中，B=空白試驗消耗的硫代硫酸鈉的毫升數（???ML）

??A=測定時消耗硫代硫酸鈉的毫升數（???ML）

??c=硫代硫酸鈉的摩爾數（???MOL）

???90.05為葡萄糖的毫克當量

酶活力=

??????=

硫代硫酸鈉溶液的標定。

準確稱取0.1g重絡酸鉀，放入500ml碘量瓶中，加20ml水溶解，加1.8g碘化鉀，15ml2mol/L鹽酸溶液，混勻，蓋好，暗處反應10min，加約200ml水稀釋，立即用0.05mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定至淺黃色，加約1ml 5%可溶性淀粉指示劑，繼續滴定至藍色消失，溶液呈綠色。

五．實驗結果分析：

⒈酶活力測定實驗的總體思路應該是什么？

答：沒活力測定實驗中都是根據酶活力的大小與催化產物的量成正比來計算酶活力大小的。

⒉由上述總體思路認為酶活力測定實驗中最關鍵的設計應該是什么？為什么？在該項設計中要注意什么？

答：在酶活力測定實驗中，最關鍵的有3點：測定酶促反應初速度、在最適條件下測定酶促反應速度以及底物濃度要遠超酶量。因為在酶促反應初期，產物濃度隨反應進程成正比例增加，隨著反應時間的延長，產物濃度的增加使逆反應速度增加、生成產物會對酶活力產生抑制、部分酶分子失活，所以要準確測定酶活力，應該測定產物濃度隨時間呈線性增加時間段的速度；其次，要在最適條件下測定酶促反應速度，酶的本質一般是蛋白質，過酸、過堿以及溫度過高都會使酶變性，而且，溶液中的離子種類和離子強度對酶活性和酶溶解度都會有一定影響，應該選擇適合的緩沖液。最后，酶活測定實驗中，必須提供足夠的底物，是所有的酶處于飽和狀態。

3.酶促反應的特點？規定酶活力單位的作用？酶活力單位想表征的內涵是什么？其規定有什么特點？

答：酶促反應的特點一是通過顯著降低反應活化能，提高催化效率；二是對催化反應具有高度專一性；三是酶促反應條件溫和，可以在常溫、常壓和有水的條件下正常進行；此外，在生物體內，酶的活性受到嚴格調節。規定酶活力單位可以表示酶催化能力即酶活性的大小。

酶活力單位想表征的內涵是單位重量樣品在一定時間內生成的麥芽糖的量。其規定特點為以酶促反應產物的生成速度來間接反應酶活力的大小。

4.所有酶活力測定方法中都有所謂的“對照管”的設計，為什么？其作用是什么？在對它的設計上有何特點？

答：對照管用于測定反應過程中酶量的變化，其設計特點就是在堿性條件下保持其活性。

????《酶工程》（第三版），郭勇編著，科學出版社，2009.

《現代生化技術》，郭勇編著，華南理工大學出版社1996.8（2006.12重?。?/div>