1.???? Phos-tag? Acrylamide的溶解

5mmmol/ Phos-tag? 液體 (3v/v% 甲醇）：

1)??? 10mg? Phos-tag? Acrylamide 里加入 0.1mL 甲醇

2)??? 使用槍頭攪拌混合直至完全溶解。

3)??? ?加3.2mL 蒸餾水， 用槍頭混勻。

2-8℃避光保存。不適合零度以下保存。建議保存時間6個月。

　　?注意：避免溶解過程出現白色懸浮顆粒。

2.???? α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated（038-23221），陽性對照（含有磷酸化和非磷酸化

　　?α-Casein），如何使用？

　　?用水或者上樣buffer溶解。用水溶解后，冷凍保存。電泳條件：Phos-tag? 50umol/L,分離膠濃度 10%。

　　?電流：30mM，1小時。

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3.???? 用Alkaline Phosphatase(for Biochemistry)（018-10693）進行磷酸化蛋白的去磷酸化反應體系。

37℃，過夜。# 10 mg/mL phosphorylated protein 50 μL
# 0.50 M Tris/HCl buffer (pH 9.0) containing 0.10 M MgCl2 10 μL
# Sterilized water 39 μL
# Alkaline phosphatase（018-10693）. 0.3 unit / 1 μL有一點需要注意:ALP活性化使用Mg離子，相

　　?同的非磷酸化蛋白質用ALP處理的樣品的條帶和沒有用ALP處理的樣品的條帶的位置不同。

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4.???? Phos-tag? SDS-PAGE實驗沒有成功分離磷酸化蛋白：

1） 使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated（038-23221）作為陽性對照，確認實驗條

件和試劑均沒有問題。

2） 可使用Phos-tag?Biotin檢測樣品中是否有磷酸化蛋白。確認有磷酸化蛋白后，再通過

Phos-tag ?SDS-PAGE進行分離鑒定。

3） 經質譜鑒定有表達磷酸化蛋白，建議增大樣品的含量，可使用Phos-tag ?Agarose進行磷酸化蛋白

的富集。磷酸化蛋白含量過低，會影響其分離效果。

4） 文獻報道有表達磷酸化蛋白，或者同源蛋白有表達磷酸化蛋白的，建議用Phos-tag? Biotin先確認

樣品中是否有磷酸化蛋白。

5） 建議樣品的pH值在7左右。酸性或者堿性條件下，Mn2⁺-Phos-tag?與磷酸化基團的特異性結合較

差。

6） 避免樣品中含有高濃度的還原劑，變性劑，表面活性劑等。β-巰基乙醇濃度不高于0.2M（或者5%）。

7） 進行Phos-tag? SDS-PAGE的佳樣品是純化的蛋白。如果是細胞裂解液，體外激酶反應液，組織均

漿液等，需要摸索佳的分離膠，Phos-tag? Acylamide的濃度。建議Phos-tag? Acrylamide濃度

從50uM開始摸索。

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5.???? Phos-tag?SDS-PAGE凝膠用于Western Blotting實驗的優化建議：

1） 可以檢測的樣品包括體外激酶反應體系，細胞裂解液，組織均漿液。

2） 每孔樣品的上樣量是10~30ug（請根據蛋白表達量進行調整）

3） 制備樣品中含有的還原劑、變性劑、螯合劑、釩酸等會使電泳條帶發生彎曲或者拖尾。通過TCA沉淀或

滲析法降低雜質含量。

4） 建議樣品的pH值在7左右。如果加入上樣緩沖液后溶液顯黃色或者橙色，加入Tris緩沖液調整pH值為7。

5） 目的蛋白分子量大于60kDa，分離膠的丙烯酰胺濃度為6%；目的蛋白分子量小于60kDa,分離膠的丙烯

酰胺濃度為8%。

6） 如果樣品中含有大量蛋白，比如細胞裂解液，組織均漿液，Phos-tag? Acylamide濃度為5~25uM。

若目的蛋白濃度低，建議Phos-tag? Acylamide濃度為100uM。

7） Phos-tag ?SDS-PAGE凝膠用于Western Blotting實驗，濕法轉膜建議：10mM EDTA的轉移緩沖液

處理凝膠10min，不含有EDTA的轉移緩沖液處理凝膠10min。重復3次。強烈建議濕法轉膜

8） Phos-tag? SDS PAGE半干法轉膜建議：

????????????? i.????? 電泳后用含有EDTA的轉移緩沖液處理凝膠，EDTA的濃度為 100mM。100mM EDTA的轉移

緩沖液處理凝膠10min，不含有EDTA的轉移緩沖液處理凝膠10min。重復3次。

???????????? ii.????? 轉膜的電流值提高2%~3%, 延長時間2成。

??????????? iii.????? 轉膜的緩沖液加SDS，加到大約0.05~0.2%，轉膜效率會提高。

9） 使用目的蛋白的非磷酸化抗體即可。比如檢測各種腫瘤細胞系中Src激酶活性實驗，用Src的非磷酸化抗

體即可。

10） 和光的WIDE-VIEW^TM Prestained Protein Siza MarkerIII(230-02461)可檢測作為轉膜效率，但是無

法判斷分子量。

11） 一般預染的蛋白marker在Phos-tag?SDS-PAGE中條帶會彎曲，無法判斷蛋白分子量。

12） 不能確認磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的分離，請進行常規的SDS-PAGE，Western Blotting實驗。比

對目的蛋白的遷移率。

13） 不能確認是因為蛋白發生磷酸化還是出現降解造成蛋白條帶遷移，請進行常規的SDS-PAGE實驗，確

認不會出現條帶遷移。

14） 目的蛋白磷酸化與非磷酸化分離效果不佳，使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated

（038-23221）作為陽性對照，確認實驗條件和試劑均沒有問題。如果確認能夠分離，調整分離膠，

Phos-tag? Acylamide的濃度。建議使用品質佳的MnCl2（139-00722）。