純化得到至多10 mg的無內毒素高轉染級純質?;蚩滤官|粒DNA
上海金畔生物科技有限公司提供凱杰Qiagen 去內毒素質粒大提試劑盒 EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) 12362/12381/12391,品質保證,價格優惠,全國聯保,歡迎咨詢。
純化得到的DNA內毒素水平低于0.1 EU/μg
純化流程快,同時去除內毒素
獲得高產量、高拷貝質粒DNA
使用LyseBlue,獲得最佳的裂解和高產量的DNA
EndoFree Plasmid Kits基于陰離子交換技術,可快速制備不含內毒素的質粒DNA。QIAfilter Cartridges過濾快速澄清裂解液。制備的DNA純度超過兩次CsCl梯度離心法所得DNA的純度,適合超轉染級純的應用。EndoFree Plasmid Buffer Set可用于制備10次mega規?;?次giga規模轉染級純質?;蚩扑官|粒DNA制備。
Performance
EndoFree Plasmid Kit將高效的內毒素去除步驟整合到質粒純化流程中,不需要額外步驟,也不需用親和柱去除脂多糖。通過QIAfilter Mega-Giga Cartridge過濾細菌裂解液,并使用重力流QIAGEN-tip陰離子交換柱純化質粒DNA。產量可達10 mg(Giga)、2.5 mg(Mega)、500 μg(Maxi)DNA。純化的DNA無內毒素(<0.1 EU/μg DNA)。
選用EndoFree Plasmid Mega Kit而非EndoFree Plasmid Giga Kit純化低拷貝質粒和科斯質粒,將會得到更好的效果,因為后者需要較大的培養體積,而QIAfilter Mega-Giga Cartridge的容量有限。
EndoFree Plasmid Kits去除細菌在裂解過程中釋放的內毒素,內毒素會影響原代細胞和敏感培養細胞的DNA轉染。從EndoFree Plasmid Kits得到的無內毒素DNA高度適用于可重復且結果可靠的轉染(參見”Plasmid purification method versus transfection efficiency”和”Plasmid purity versus transfection efficiency”及表”Endotoxin levels in plasmid preparations”和”EndoFree DNA yields high transfection efficiencies with primary cells”)。QIAGEN超純無內毒素DNA也適用于基因治療研究和其他敏感應用。
質粒制備中的內毒素水平*
質粒制備方法 | 內毒素(EU?/μg DNA) | 平均轉染效率? |
EndoFree Plasmid Kit | 0.1 | 154% |
QIAGEN Plasmid Kit | 9.3 | 100% |
2x CsCl | 2.6 | 99% |
Silica-gel slurry | 1230.0 | 24% |
* 宿主菌:大腸桿菌DH5α? 質粒:pRSVcat。
? 1? ng LPS = 1.8 EU。
? 根據表中數據計算 。
無內毒素DNA轉染原代細胞的高轉染率*
DNA純化方法 | 轉染細胞比例 |
EndoFree Plasmid Kit | 21.0% ± 0.93 |
QIAGEN Plasmid Kit | 8.1% ± 0.57 |
Silica-gel slurry | 5.2% ± 0.74 |
* 原代兔胃壁細胞轉染pEGFP-N2(CLONTECH),pEGFP-N2由所示的方法制備。使用Effectene Transfection Reagent進行轉染。該數據是細胞表達GFP的百分率,由轉染48小時后綠色熒光細胞數量確定。轉染效率是每種純化方法制備的超過2個不同的DNA中6–9個復制樣本的平均值。(數據由C. Chew and J. Parente提供,Department of Molecular Medicine and Genetics, Medical College of Georgia, Augusta, Georgia, USA.)
Principle
純化的質粒DNA內毒素污染水平取決于所用的純化方法(參見”Endotoxin levels in plasmid preparations”)。硅膠技術純化的DNA具有非常高的內毒素水平。QIAGEN、QIAfilter、HiSpeed Plasmid Kits和兩次CsCl超速離心可獲得相對低水平內毒素的純DNA。EndoFree Plasmid Buffer Set包含完整的內毒素去除步驟,獲得<0.1 EU/μg的質粒DNA。
QIAfilter、HiSpeed和EndoFree Plasmid Kits提供的QIAfilter Cartridges是特殊設計的過濾裝置,用于代替細菌細胞堿裂解后的離心步驟。QIAfilter Cartridges可完全去除SDS沉淀,清除細菌裂解液,相比離心可大量節約時間,減少1小時的質粒純化時間。QIAfilter Mega-Giga Cartridges采用內部真空方式輕松高效的清除大量細菌裂解液(注意:該試劑盒不包含瓶子)。
QIAGEN-tips中獨特的陰離子交換樹脂(不提供EndoFree Plasmid Buffer Set)專為核酸純化而開發。它卓越的分離性能使得DNA純度與連續兩次CsCl梯度離心獲得的DNA純度相當。由重力流驅動并持續運轉的預裝QIAGEN-tips,最大限度減少手動制備質粒所需的時間。整個QIAGEN質粒純化系統不使用有毒物質,如苯酚,氯仿,溴化乙錠和CsCl,最大限度地減少對用戶和環境的危害。
內毒素,又稱脂多糖或LPS,是大腸桿菌等革蘭氏陰性菌細胞膜的組成部分,如大腸桿菌(參見”Bacterial cell wall”)。內毒素在質粒裂解純化過程中釋放出來,并顯著降低內毒素敏感細胞株的轉染效率。此外,內毒素與DNA競爭“自由”轉染試劑,影響轉染實驗中質粒DNA的攝取。內毒素也誘導巨噬細胞和B細胞等免疫細胞發生非特異性免疫反應,從而導致轉染結果的誤讀。這些反應包括誘導的蛋白質和脂類,如IL-1和前列腺素等的合成??傮w而言,內毒素在轉染實驗中是不可控變量,影響結果的可重復性,使它們難以對比、解讀。在基因治療研究中,內毒素可造成內毒素休克綜合癥和激活補體級聯,干擾研究。
Procedure
在堿性條件下,細菌細胞裂解,使用QIAfilter Mega-Giga Cartridge清除粗裂解物。將Endotoxin Removal Buffer加入到過濾后的裂解液中。冰浴后,將純凈的裂解物上樣到陰離子交換柱上,在適當的低鹽和pH條件下,質粒DNA選擇性結合。用中鹽緩沖液清除RNA、蛋白質、代謝產物和其他低分子量雜質,超純質粒DNA被高鹽緩沖液洗脫(參見”QIAGEN Plasmid Kit procedures”)。最后DNA由異丙醇脫鹽、沉淀并且離心回收。
Applications
使用EndoFree Plasmid Kits純化的DNA適合多種敏感應用,包括:
轉染,包括原代、敏感以及懸浮細胞
基因治療研究
基因沉默
顯微注射